1. pH pufrovacího systému je rozhodující pro dosažení optimálních kultivačních podmínek a obvykle se ho dosahuje pomocí jednoho z následujících pufrovacích systémů:
1. Přírodní pufrovací systém V přirozeném pufrovacím systému je plynný CO2 vyvážen s obsahem CO3/HCO3 v kultivačním médiu. Kultury s přirozenými pufrovacími systémy je třeba udržovat ve vzdušné atmosféře obsahující 5-10 % CO2, obvykle udržované v inkubátoru CO2. Přírodní nárazníkové systémy jsou levné a netoxické.
2. HEPES HEPES má vynikající pufrovací kapacitu v rozsahu pH 7.{2}}.4 a nevyžaduje řízenou atmosféru. HEPES je ve vyšších koncentracích relativně drahý a toxický pro některé typy buněk. HEPES však značně zvyšuje citlivost kultivačního média na fototoxické účinky expozice fluorescenci.
3. Fenolová červeň Většina komerčních kultivačních médií obsahuje fenolovou červeň jako indikátor pH, který umožňuje, aby pH zůstalo konstantní. Během růstu buněk se barva kultivačního média mění, jak se mění metabolity uvolňované buňkami. Při nízkých hodnotách pH zbarví fenolová červeň kultivační médium do žluta, zatímco při vyšších hodnotách pH zbarví kultivační médium do fialova. Pro pH 7,4 je kultivační médium jasně červené, což je optimální pH pro buněčnou kulturu. Použití fenolové červeně má však některé nevýhody: 1) Fenolová červeň napodobuje účinky některých steroidních hormonů, zejména estrogenu. Proto se při studiu buněk citlivých na estrogen, jako je prsní tkáň, doporučuje používat médium bez fenolové červeně. 2) Fenolová červeň je přítomna v některých formulacích bez séra, což může narušit rovnováhu sodíku a draslíku. Tento účinek lze neutralizovat přidáním séra nebo hormonů hovězí hypofýzy do kultivačního média. 3) Fenolová červeň interferuje s detekcí ve studiích průtokové cytometrie.
2. Anorganické soli Anorganické soli v kultivačním médiu pomáhají udržovat osmotickou rovnováhu a regulují membránový potenciál poskytováním sodíkových, draselných a vápenatých iontů.
3. Aminokyseliny Aminokyseliny jsou surovinou proteinů a jsou proto základními složkami všech známých buněčných kultivačních médií. Esenciální aminokyseliny musí být obsaženy v kultivačním médiu, protože buňky si je nemohou samy syntetizovat. Jsou nezbytné pro buněčnou proliferaci a jejich koncentrace určuje maximální dosažitelnou hustotu buněk. Mezi nimi je zvláště důležitá jedna esenciální aminokyselina, L-glutamin. L-glutamin poskytuje dusík pro NAD, NADPH a nukleotidy a slouží jako sekundární zdroj energie pro metabolismus. L-glutamin je nestabilní aminokyselina, která se časem přemění na formu, kterou buňky nemohou využít, a proto by měla být přidána do kultivačního média před použitím. Pokud je L-glutamin přidán v přebytku, než je množství požadované ve složení původního kultivačního média, měl by být používán s opatrností, protože jeho degradace může vést k akumulaci amoniaku, což může mít nepříznivé účinky na některé buněčné linie. Koncentrace L-glutaminu v kultivačním médiu savčích buněk může být 0,68 mM v médiu 199 a 4 mM v DMEM. Kultivační médium pro buňky bezobratlých může obsahovat až 12,3 mM L-glutaminu. Doplňky jako Glutamax jsou stabilnější a mohou nahradit glutamin pro dlouhodobou kultivaci pomalých buněk. Do kultivačního média lze také přidat neesenciální aminokyseliny, aby se nahradily aminokyseliny, které jsou během růstu vyčerpány. Přidáním neesenciálních aminokyselin do kultivačního média lze stimulovat buněčný růst a prodloužit přežití buněk.
4. Sacharidy Sacharidy ve formě cukrů jsou hlavním zdrojem energie. Většina kultivačních médií obsahuje glukózu a galaktózu, ale některá obsahují také maltózu a fruktózu.
5. Proteiny a peptidy Nejčastěji používanými proteiny a peptidy jsou albumin, transferin a fibronektin. Jsou zvláště důležité v bezsérových kultivačních médiích. Sérum je bohatým zdrojem bílkovin, včetně albuminu, transferinu, trypsinu, fetálního hovězího sérového albuminu a fibronektinu. Albumin je hlavní protein v krvi a hraje roli při vázání vody, solí, volných mastných kyselin, hormonů a vitamínů a jejich transportu mezi tkáněmi a buňkami. Vazebná schopnost albuminu z něj činí vhodný odstraňovač toxických látek v buněčných kultivačních médiích. Trypsin je ochranný prostředek v systémech buněčných kultur, stabilní při neutrálním a kyselém pH a odolný vůči vysoké teplotě a degradaci proteáz. Je schopen inhibovat několik serinových proteáz, jako je trypsin. Fetální bovinní sérový albumin je glykoprotein ve fetálním a neonatálním séru a jeho koncentrace je vyšší než v séru dospělých. Je také inhibitorem serinových proteáz. Fibronektin je klíčovým faktorem při uchycení buněk. Transferin je protein transportující železo, který dodává železo buněčným membránám.
6. Mastné kyseliny a lipidy jsou zvláště důležité v kultivačních médiích bez séra, protože jsou obvykle přítomny v séru.
7. Vitamíny Mnoho vitamínů je nezbytných pro buněčný růst a proliferaci. Buňky si nedokážou samy syntetizovat vitamíny v dostatečném množství, proto jsou tyto vitamíny důležitými doplňky v tkáňové kultuře. Opět platí, že hlavním zdrojem vitamínů v buněčné kultuře je sérum, ale kultivační média jsou také obohacena o různé vitamíny, aby byla vhodná pro specifické buněčné linie. K podpoře růstu se nejčastěji používají vitamíny skupiny B.
8. Stopové prvky Do médií bez séra se často přidávají stopové prvky, které nahrazují ty, které jsou běžně obsaženy v séru. Stopové prvky, jako je měď, zinek, selen a meziprodukty kyseliny trikarboxylové, jsou chemické prvky potřebné pro růst buněk. Tyto stopové prvky jsou nezbytné pro mnoho biologických procesů, například pro udržení funkce enzymů.
9. Doplňky médií Kultivační média používaná k růstu některých buněčných linií vyžadují další složky, které nejsou obsaženy v základním médiu a séru. Tyto doplňky pomáhají udržovat buněčnou proliferaci a udržovat normální buněčný metabolismus. Ačkoli jsou pro normální růst některých buněčných linií vyžadovány doplňky, jako jsou hormony, růstové faktory a signální látky, je nejlepší přijmout následující opatření: Protože přidání doplňků mění osmotický tlak celého růstového média, které může mít negativní dopad na růst buněk, je nejlepší znovu zkontrolovat osmotický tlak po přidání doplňků. Pro většinu buněčných linií by optimální osmolarita měla být mezi 260 mOSM/kg a 320 mOSM/kg. Doba použitelnosti média se po přidání doplňků změní. Kompletní médium obsahující proteinové doplňky se rozloží rychleji než samotné bazální médium.
10. Antibiotika Ačkoli to není požadavek pro buněčný růst, antibiotika se často používají ke kontrole bakteriální a plísňové kontaminace. Antibiotika se pro buněčnou kulturu nedoporučují, protože mohou maskovat kontaminaci mykoplazmaty a rezistentními bakteriemi. Kromě toho mohou antibiotika ovlivnit metabolismus citlivých buněk. Plasmocin může eliminovat mykoplazmatickou kontaminaci a byl použit ke kultivaci gliomových buněčných linií TS603, TS516 a BT260. Kromě toho mohou být primární buněčné kultury také kontaminovány houbami, prvoky a rostlinnými buňkami, což je způsobeno hostitelem nebo jinými podmínkami. Herbicidy/glyfosát isopropylamin/(2-hydroxyethyl)aminomethylfosfonová kyselina isopropylamin lze použít proti rostlinným buňkám; proti plísním lze použít ampicilin B a flukonazol; proti prvokům lze použít pentazolin nebo atovachon.
11. Sérum v kultivačním médiu Sérum je komplexní směs obsahující albumin, růstové faktory a růstové inhibitory. Sérum je jednou z nejdůležitějších složek buněčného kultivačního média a je zdrojem aminokyselin, bílkovin, vitamínů (zejména vitamínů rozpustných v tucích jako A, D, E a K), sacharidů, lipidů, hormonů, růstových faktorů, minerály a stopové prvky. Fetální hovězí a telecí sérum se běžně používá k podpoře růstu buněk v kultuře. Fetální bovinní sérum je bohatým zdrojem růstových faktorů a je vhodné pro klonování buněk a buněčný růst za přísných podmínek. Telecí sérum se často používá ve studiích kontaktní inhibice, protože má nižší účinek na podporu růstu. Běžná růstová média obvykle obsahují 2-10 % séra. Přidání séra do kultivačního média má následující funkce:
• Poskytuje základní živiny pro buňky.
• Poskytuje několik růstových faktorů a hormonů, které podporují růst a regulují buněčnou funkci.
• Poskytuje několik vazebných proteinů, jako je albumin a transferin, které mohou transportovat další molekuly do buňky. Například albumin transportuje do buňky tuky, vitamíny, hormony atd.
• Poskytuje proteiny, které podporují připojení buněk k matrici, jako je fibronektin.
• Poskytuje expanzní faktory, které pomáhají buňkám expandovat dříve, než se začnou dělit.
• Poskytuje inhibitory proteázy k ochraně buněk před degradací proteázy.
• Poskytuje minerály, jako je Na+, K+, Zn2+, Fe2+ atd.
• Zvyšuje viskozitu kultivačního média, čímž chrání buňky před mechanickým poškozením během míchané suspenzní kultury.
• Působí jako nárazník. Protože sérum obsahuje jak růstové faktory, tak inhibitory, je role séra v buněčné kultuře velmi komplexní. I když však sérum plní různé funkce, má v tkáňové kultuře určité nevýhody.