1. Jaký je rozdíl mezi DDA a DIA?
Jak DDA, tak DIA jsou považovány za metody založené na objevech v proteomice zdola nahoru. To znamená, že v obou případech jsou proteiny enzymaticky štěpeny na menší peptidy a z peptidů jsou extrahovány informace pro vyvození závěrů na úrovni proteinů. V DIA jsou téměř všechny peptidy fragmentovány dohromady a poté analyzovány pomocí hmotnostní spektrometrie. Tato technika produkuje spektra komplexní fragmentace (MS2), ale shromažďují se data MS2 pro všechny peptidy v celém rozsahu retenčního času. Po těchto počátečních krocích metoda DIA využívá spektrální knihovny k extrakci informací z vysoce hojných dat a umožňuje kvantifikaci na úrovni MS2. Díky těmto vlastnostem poskytuje DIA nesrovnatelnou přesnost a kvantitativní přesnost, zlepšenou reprodukovatelnost a komplexnější vzorkování peptidů než DDA. Hmotnostní spektrometr v režimu DDA oproti DIA vybírá pouze určité peptidy a následně je fragmentuje, ideálně jeden po druhém. Zatímco DIA je vynikající metoda získávání kvantitativních cílů, DDA je preferovanou metodou pro vytváření knihoven a vyhledávání v databázi, protože má téměř peptidově specifická MS2 spektra. To platí zejména v kombinaci s hlubokou frakcionací. Na základě algoritmu vyhledávače aplikovaného na existující proteinové databáze může DDA rychle poskytnout výsledky identifikace.
2. Existuje rozdíl mezi použitím „Prázdného dokumentu“ a zadáním vyhledávání peptidů DIA?
Zadáním vyhledávání peptidů DIA vás provede formulář, který jste odeslali. Všechny stejné výsledky nebo více můžete získat výběrem „Prázdný dokument“ a poté pomocí Nastavení > Nastavení peptidů a Nastavení přechodu iontů, Soubor > Import FASTA, Optimalizace > Přidat návnadu, Soubor > Import > Výsledky, Optimalizovat > Znovu integrovat. Jinými slovy, pokud víte, čeho chcete dosáhnout, můžete získat maximální výkon a flexibilitu navigací v možnostech přímo v uživatelském rozhraní Skyline. Pokud ne, pak by pro vás měly být pohodlnější možnosti zadávání vyhledávání DIA peptidů. Poté, co vyberete "Prázdný dokument", můžete také vyvolat tento formulář přes Soubor > Import > Vyhledávání peptidů a možná provést nějaké předběžné úpravy chybějících částí formuláře pro vyhledávání peptidů.
3. Jaké jsou rozdíly v metodách získávání dat mezi DDA proteomikou, DIA proteomikou a cílenou proteomikou? Jaké jsou jejich výhody a omezení?
1. DDA-Data Dependent Acquisition: Klasická brokovnicová proteomika. Hmotnostní spektrometr vybírá ionty s nejvyšší intenzitou v MS1 pro ionizaci MS2. Výhody: Nestranná detekce proteinů. Nejsou vyžadovány žádné předchozí předpoklady. Nevýhody: Protože různé peptidy jsou detekovány v různých cyklech, analyzované proteiny mají nízkou reprodukovatelnost a velké dávkové účinky. To také vede ke ztrátě mnoha dat. Při stanovení nejvyššího obsahu bílkovin v testovaném vzorku jsou velké chyby, zejména u vzorků plazmy s velkým dynamickým rozsahem kolísání koncentrace bílkovin. 2. DIA-Data Independent Acquisition: "Posuvné okno" vybírá ionty MS1 s určitým rozsahem poměru hmotnosti k náboji pro následnou analýzu MS2, čímž se dosáhne skenovací analýzy všech iontů. Výhody: Nestranná detekce proteinů. Nejsou vyžadovány žádné předchozí předpoklady. Lze detekovat velké množství proteinů. Nevýhody: Získává se příliš mnoho dat, což má za následek snížení rychlosti analýzy dat. Protože se shromažďuje příliš mnoho dat, je k získání intenzity jednotlivých peptidů nutná komplexní analýza dat a k dosažení tohoto účelu se obvykle používají databáze peptidů.
3. Cílená čs
Jakýkoli typ hmotnostní spektrometrie analýzy cílového peptidu, v praxi obvykle SRM nebo PRM, případně se stabilním izotopovým standardem (SIS). Výhody: Méně dávkových efektů. SIS umožňuje lepší kvantifikaci, dokonce i absolutní kvantifikaci. Dobrá reprodukovatelnost, méně chybějících dat. Nevýhody: Je třeba vyvinout cílenou analýzu. Před experimentem je nutné určit, které proteiny analyzovat. SIS je drahá.